次氯酸鈣大腸桿菌殺滅率檢測(cè)技術(shù)規(guī)范與方法優(yōu)化研究

一、檢測(cè)原理與標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)

（一）殺菌機(jī)制

次氯酸鈣溶于水釋放次氯酸（HClO），通過(guò)以下途徑殺滅大腸桿菌（Escherichia coli 8099）：

1.細(xì)胞膜破壞：HClO穿透細(xì)胞壁，氧化磷脂雙分子層；

2.蛋白質(zhì)變性：與酶活性中心巰基（-SH）反應(yīng)，抑制代謝酶活性；

3.DNA損傷：破壞核酸結(jié)構(gòu)，阻止細(xì)胞復(fù)制1。

（二）標(biāo)準(zhǔn)方法

國(guó)標(biāo)：GB/T 27952-2020《消毒劑衛(wèi)生要求》懸液定量殺滅試驗(yàn)；

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)：EN 1276《化學(xué)消毒劑和防腐劑 食品、工業(yè)、家庭和公共區(qū)域用化學(xué)消毒劑殺菌活性評(píng)價(jià)》2。

二、試驗(yàn)材料與試劑配制

（一）菌株與培養(yǎng)基

1.標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸桿菌8099（CMCC(B) 44102），由中國(guó)普通微生物菌種保藏中心提供；

2.培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA），pH 7.0±0.2，121℃滅菌20分鐘1。

（二）關(guān)鍵試劑

次氯酸鈣溶液：

母液：稱(chēng)取0.5 g次氯酸鈣（有效氯65%），用無(wú)菌水溶解定容至100 mL，有效氯濃度3250 mg/L；

工作液：用PBS稀釋至500 mg/L（按殺滅要求調(diào)整）3。

中和劑：

0.1%硫代liu酸鈉（Na?S?O?）溶液，中和有效氯至＜0.1 mg/L1。

三、試驗(yàn)流程與操作規(guī)范

（一）菌懸液制備

活化培養(yǎng)：

將凍干菌種接種至NA斜面，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)；

挑取單菌落轉(zhuǎn)接至營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃振蕩培養(yǎng)6小時(shí)（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）。

稀釋與干擾物添加：

用0.03 mol/L PBS（含10%小牛血清）稀釋菌液至1×10? CFU/mL；

混勻后備用，2小時(shí)內(nèi)使用2。

（二）殺滅試驗(yàn)步驟

樣品處理：

取5 mL次氯酸鈣工作液（500 mg/L）至滅菌試管，37℃水浴預(yù)熱5分鐘；

加入5 mL菌懸液（1×10? CFU/mL），立即計(jì)時(shí)并混勻。

作用與終止：

20℃±1℃避光作用10分鐘（按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)調(diào)整作用時(shí)間）；

取1.0 mL混合液至9.0 mL中和劑，混勻后靜置10分鐘1。

培養(yǎng)與計(jì)數(shù)：

取中和后液體1.0 mL，用PBS梯度稀釋?zhuān)?0?1-10?3）；

各稀釋度取0.5 mL傾注NA平板，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)菌落數(shù)（CFU）2。

（三）對(duì)照組設(shè)置

對(duì)照組類(lèi)型操作步驟作用

陽(yáng)性對(duì)照組菌懸液+PBS（不加消毒劑）驗(yàn)證菌活性

陰性對(duì)照組中和劑+培養(yǎng)基驗(yàn)證無(wú)菌操作

中和劑對(duì)照組消毒劑+中和劑+菌懸液驗(yàn)證中和劑有效性

四、結(jié)果計(jì)算與判定標(biāo)準(zhǔn)

（一）殺滅率計(jì)算

殺滅率（）

符號(hào)說(shuō)明：

試驗(yàn)組活菌數(shù)（CFU/mL）；

陽(yáng)性對(duì)照組活菌數(shù)（CFU/mL）1。

（二）判定標(biāo)準(zhǔn)

產(chǎn)品類(lèi)型作用時(shí)間（min）有效氯濃度（mg/L）殺 滅率要求（%）

飲用水消毒劑                             10                          500≥99.9

物體表面消毒劑                     5                                 800≥99.99

五、影響因素與優(yōu)化策略

（一）關(guān)鍵因素控制

因素                            優(yōu)化條件                                         效果

有效氯濃度  500-1000 mg/L（根據(jù)有機(jī)物調(diào)整）  殺滅率提升至99.99%

作用pH               6.5-7.5（中性條件）                  HClO占比達(dá)80%以上

溫度20-25℃         溫度每升高10℃，                           殺滅時(shí)間縮短一半

（二）常見(jiàn)問(wèn)題解決方案

問(wèn)題現(xiàn)象                                 原因分析                                  解決措施

殺滅率偏低有 效氯濃度不足或中和劑過(guò)量重新標(biāo)定濃度，調(diào)整中和劑用量至9 mL

菌落蔓延                            菌懸液濃度過(guò)高                         增加稀釋梯度至10??

中和劑失效                  硫代liu酸鈉氧化                          使用新鮮配制的中和劑

六、質(zhì)量控制與應(yīng)用場(chǎng)景

（一）質(zhì)控指標(biāo)

1.菌懸液濃度：1×10?±0.5×10? CFU/mL；

2.中和劑有效性：中和后殘留菌數(shù)≤10 CFU/mL2。

（二）典型應(yīng)用

1.飲用水消毒：驗(yàn)證次氯酸鈣投加后大腸桿菌達(dá)標(biāo)（≤0 CFU/100 mL）；

2.醫(yī)療環(huán)境表面：物體表面擦拭后殺滅率≥99.99%1。

關(guān)鍵詞：次氯酸鈣；大腸桿菌；殺滅率；懸液定量試驗(yàn)；GB/T 27952

參考文獻(xiàn)

[1] GB/T 27952-2020 消毒劑衛(wèi)生要求[S].

[2] EN 1276 化學(xué)消毒劑殺菌活性評(píng)價(jià)[S].

[3] WHO 飲用水消毒指南[S].